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怎樣用恒溫培養箱做蛋白定量濃度實驗?
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怎樣用恒溫培養箱做蛋白定量濃度實驗?

發布日期:2017-12-28 作者: 點擊:

1、吸棄培養皿中的培養液。

2、往培養皿中加入2ml 冷的PBS輕輕蕩洗2~3次,最後一次,吸幹培養皿中的PBS。

3、每個培養皿中加入70μl(以FLS細胞為例)裂解液。

裂解液的配置:

RIPA裂解液:蛋白酶/磷酸酶抑製劑混合物:RIPA裂解液(中)B=100:1:1
(配置時實際配置的體積需比理論值高出幾十微升)

4、將加入裂解液的培養皿輕輕搖晃,使裂解液與貼壁細胞充分接觸,放入—70℃的冰箱,冷凍10分鍾。

5、裂解完後,用幹淨的刮刀將細胞刮於培養皿的一處(動作要快,每個皿控製在3min),然後用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml 離心管中。(整個操作盡量在冰上進行)

6、將離心管置於小型離心機上渦旋一下,然後置於4℃冰箱放置30min。(期間從冰箱拿出再進行渦旋一次)

7、將離心管放入高速離心機,於4度下12000rpm 離心5min。(提前開離心機預冷)

8、取出離心管,吸取上清液,上清液即蛋白液,對其進行定量,轉移至新的1.5ml離心管。(定量需用精準的槍。)

9、對提取的上清液進行蛋白濃度的定量

蛋白定量的過程

①取幹淨的96孔板,進行區域選擇板底掃描即讀板(切勿用手觸摸板底)

②首先在96孔板中加入18ulPBS(做標準曲線的PBS

③在18ulPBS中加入2ul的樣品

④最後在加入200ulBCA(加入後的BCA不進行與樣品的混合,而是鋪在樣品的上麵,用吹風機除去上方的氣泡)

BCA的配置: BCA試劑A:BCA試劑B=50:1

⑤放置37°恒溫培養箱孵育30min

⑥讀板(吸光光度值為562

10、對剩餘的樣品按照體積5:1的比例加入Loading Buffer6X

11、將加好的樣品放入離心機順離,使離心管內壁的樣品甩下。

12、將樣品放入恒溫金屬浴鍋中100℃煮7min

13、將煮好的蛋白放入—20℃冰箱中備用(在離心管壁上標記好樣品名稱、日期)


本文網址:http://www.iusolarltd.com/news/384.html

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